DUOPAP e TRIPAP, indicazioni cliniche e vantaggi diagnosi preventiva

Dott.ssa Elena Casolati, Clinica Ostetrico-Ginecologica, Azienda ospedaliera L. Sacco

Premessa

Il carcinoma invasivo della cervice uterina rappresenta il primo tumore maligno della donna nei Paesi in via di sviluppo ed il secondo nel mondo: l'età di incidenza massima delle forme invasive è intorno ai 45-50 anni e la diagnosi della malattia in fase clinica determina come conseguenza una terapia chirurgica demolitiva (asportazione dell'utero) con perdita della fertilità e una alta mortalità nelle forme diagnosticate in fase avanzata.
La prevalenza è variabile da nazione a nazione ma è in media di 7-8 casi/100.000.
Negli Usa si stima una incidenza ancora oggi di circa 12800 carcinomi invasivi/anno ed un numero di morti per anno di circa 4800. In Europa ogni anni circa 13.000 donne muoiono per questa malattia.
La caratteristica principale di questo tumore rispetto agli altri dell'apparato genitale femminile (endometrio, ovaio, vagina, vulva) è che ne sono note con precisione cause, fattori di rischio e storia naturale.
Inoltre è possibile effettuare una diagnosi precoce e quindi uno screening delle lesioni potenzialmente evolutive tramite un metodo semplice e poco costoso: il PAP TEST.

Cause

Il carcinoma della cervice uterina è causato da un virus, il papillomavirus umano, HPV.
E' un virus specie specifico di cui oggi sono noti circa 150 sierotipi differenti.
Dei tipi conosciuti oggi è noto che solo alcuni, i cosiddetti ceppi ad alto rischio oncogeno (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) sono in grado di determinare una trasformazione neoplastica delle cellule infettate, integrandosi nel genoma (DNA) cellulare.
A conferma di ciò pressochè il 100% dei tumori cervicali invasivi contengono DNA virale nelle cellule tumorali.
Gli altri sierotipi (cosidetti a basso rischio) sono molto raramente coinvolti nella genesi dei tumori cerviclai, determinanodo principalmente lesioni genitali produttive, contagiose, ma prive di rischio neoplastico, i condilomi genitali.

Fattori di rischio

L'infezione da HPV è trasmessa sessualmente in oltre il 95% dei casi: è la MST più frequente, e oltre il 75% della popolazione sessualmente attiva ha contratto una infezione da HPV.
Il rischio di infezione è correlato all'età del primo rapporto sessuale, al numero dei partners sessuali, ma nella maggior parte dei casi l'infezione decorre in forma subclinica o latente e viene eliminata, come altre infezioni virali, in un tempo medio di circa 7.5 mesi fino ad un massimo di 5 anni.
La lunghezza del tempo necessario per la attivazione dei meccanismi di difesa e clearance virale è legata in primo luogo al fatto che il virus "si nasconde" all'interno delle cellule epiteliali infettate rendendo difficile il suo riconoscimento da parte dei meccanismi di difesa immunitaria che sono legati alla immunità cellulare (linfociti T) piuttosto che a quella umorale (linfociti B, produttori di anticorpi).
La compromissione delle difese immunitarie, e in particolare la infezione da virus HIV rappresenta un ulteriore fondamentale fattore di rischio non solo per la acquisizione della infezione, ma soprattutto per la sua persistenza nel tempo.
In misura minore, anche il fumo di sigaretta che ha azione immunodepressiva, rappresenta un fattore di rischio per acquisizione e persistenza dell'infezione.
Se il/i tipi virali acquisiti sono ad alto rischio oncogeno, il virus tenderà ad integrarsi all'interno del DNA cellulare determinando modificazioni di tipo preneoplastico che potranno regredire, rimanere a lungo immutate o progredire a neoplasia invasiva.
Ciò dipenderà dalle caratteristiche del virus (tra i tipi ad alto rischio, il 16 e il 18 sono particolarmente "aggressivi"), dalla carica virale (tanto maggiore è la quantità di virus presente, tanto più alto è il rischio di trasformazione e progressione), e dalle difese dell'ospite (se vi è immunodepressione aumenta il rischio di persistenza e progressione).

Storia naturale

Per storia naturale si intendono i fenomeni che si verificano a livello dell'epitelio infettato da virus HPV ad alto rischio e che precedono necessariamente lo sviluppo della neoplasia invasiva.
Il concetto di neoplasia cervicale intraepiteliale introdotto da Richart nel 1967 definisce appunto le lesioni preneoplastiche che precedono il tumore invasivo e che interessano le cellule del'epitelio che riveste il collo dell'utero.
Si tratta di lesioni che rimangono confinate all'interno dello spessore dell'epitelio cervicale e che si distinguono tra loro per la gravità ed estensione dalla profondità alla superficie dello strato epiteliale di fenomeni di sdifferenziazione cellulare, anomalie del rapporto nucleo citoplasma, perdita di polarità, numero di mitosi.
Nelle lesioni di basso grado (CIN1, L-SIL) le anomalie interessano solo lo strato basale dell'epitelio, mentre nelle lesioni di alto grado (CIN2-CIN3, H-SIL) le anomalie interessano i 2/3 e tutto lo spessore del rivestimento epiteliale.
E' da sottolineare che non vi è un continuum L-SIL --> HSIL --> neoplasia invasiva, ma che anche una lesione lieve può evolvere direttamente a carcinoma.
Le lesioni preneoplastiche hanno però una evoluzione lenta, essendo il tempo medio di intervallo tra lesione e tumore di circa 7 anni. Inoltre le lesioni possono regredire, restare inalterare o progredire in relazione ai fattori già citati relativi al virus ed all'ospite, con un massimo di probabilità di regressione (> 80%) per le L-SIL e minimo (< 8%) per le H-SIL.
Queste lesioni sono individuabili e distinguibili dall'epitelio normale e possono essere trattate evitando la comparsa di un tumore invasivo.
E' quindi possibile effettuare una prevenzione del tumore cervicale tramite lo screening sulla popolazione a rischio per individuare le lesioni cervicali preneoplastiche.

Prevenzione

Le cellule che rivestono il collo dell'utero sono cellule epiteliali di tipo squamoso (esocervice) e cilindrico(endocervice). Come tutte le cellule epiteliali esfoliano rapidamente (cadono per essere sostituite da nuovi elementi cellulari) e possono quindi essere raccolte. Le cellule SIL hanno un aspetto differente da quelle normali e possono essere quindi identificate e definite in vari stadi di anomalie: questo è il PAP test (dal nome del suo inventore, Papanicolau) o striscio cervicovaginale.
Il Pap test è un esame semplice, indolore, poco costoso ed estremamente efficace: si calcola che dallla sua introduzione l'incidenza e la mortalità del cervicarcinoma nel mondo siano calate del 60% e se tutte le donne si sottoponessero periodicamente al Pap test si otterrebbe una riduzione del cervicocarcinoma di oltre il 90%.
Il Pap test viene eseguito dal ginecologo o da una infermiera addestrata tramite l'applicazione dello speculum e prelievo delle cellule tramite spatola di Ayre in legno o plastica dall'esocervice ed uno spazzolino (citobrush) dal canale cervicale. Il materiale raccolto viene quindi strisciato su un vetrino, fissato ed inviato in laboratorio dove il vetrino verrà previa colorazione esaminato dal citologo per la diagnosi citologica.
La diagnosi segue precise classificazioni, la più recente è quella di Bethesda del 2001 che ha introdotto il termine di L-SIL al posto di CIN1 e HPV e di H-SIL al posto di CIN2-CIN3 e Ca in situ.
Inoltre sono stati rivisti i criteri per definire la categoria degli strisci dubbi, oggi denominati ASC ed AGC (cellule squamose o ghiandolari di incerto significato) e che rappresentano almeno il 5% dei risultati citologici.
La popolazione oggetto dello screening è rappresentato da tutte le donne in età compresa tra i 25 e i 65 anni (ma si può iniziare più precocemente in relazione all'età del primo rapporto sessuale), lo screening può essere programmato su scala regionale o nazionale oppure può essere volontario.
L'intervallo di screening tra un test ed il successivo dovrebbe essere di 1-3 anni.
Di fronte ad una diagnosi citologica di anomalie delle cellule squamose o cilindriche il passo successivo è rappresentato dalla diagnostica di II livello, rappresentata dalla colposcopia.
La colposcopia è un esame microscopico della cervice che viene osservata dopo applicazione dello speculum e di appositi reagenti con un microscopio binoculare. Le aree interessate da anomalie vengono individuate, sottoposte a biopsia mirata ed in base all'esito dell'esame istologico si potrà effettuare un trattamento spesso di tipo ambulatoriale che prevede la distruzione delle lesioni (DTC o laservaporarizzazione) o la loro escissione con varie metodiche (conizzazione con ansa diatermica, laser, bisturi).
Tutte le pazienti trattate per SIL dovrannno successivamente essere sottoposte a controlli periodici citologici e colposcopici ogni 6-12 mesi per un periodo di 5-10 anni in relazione al rischio di recidiva che è compreso tra il 5 e il 30%.
La Società italiana di colposcopia e patologia cervicovaginale (SICPCV) ha definito precisi criteri di diagnosi, trattamento e follow up delle lesioni cervicali HPV correlate a cui attenersi (linee guida).

I limiti del PAP TEST e della colposcopia

Le caratteristiche ideali di un test di screening sono l'alta sensibilità (basso numero di risultati falsi negativi) e l'alta specificità (basso numero di falsi positivi).
Il pap test tradizionale ha una teorica sensibilità del 80% (falsi negativi 20%) ed una specificità del 99% (falsi positivi 1%).
Nella realtà il numero di falsi negativi può raggiungere il 50%, mentre i falsi positivi reali si attestano al 5%. Ciò è dovuto a errori del prelievo (materiale scarso, assenza di cellule endocervicali), presenza di sangue o di intensa flogosi che alterano il campione, errori di lettura.
Inoltre i risultati falsi negativi possono essere dovuti anche alle dimensioni della lesione (lesione di minime dimensioni, con poche cellule coinvolte che quindi non sono individuate dal prelievo) o ad un errato intervallo di screening (se i pap test vengono eseguiti ad intervalli di tempo molto lunghi tra loro o troppo ravvicinati perdono di efficacia perché aumenta la probabilità di errore).
Un alto numero di falsi negativi limita quindi molto il significato del Pap test perché determina come conseguenza la possibilità di non individuare precocemente le lesioni preinvasive.
A ciò si aggiunge il dato dei risultati dubbi (ASCed AGc) che rappresentano almeno il 5% degli esiti e la cui gestione da parte del clinico rimane controversa (ripetere il Pap test a breve termine? Eseguire subito la colposcopia?) e che determinano ansia nella donna (tenedo presente che in circa il 5-25% degli ASC-AGC vi è in realtà una SIL di alto grado alla biopsia).
In caso di Pap test anormale o di Pap test con risultato dubbio la paziente dovrà EFFETTUARE UN TEST DIAGNOSTICO RAPPPRESENTATO DALLA COLPOSCOPIA.
La colposcopia PERO' può non sempre giungere ad una diagnosi: esistono infatti situazioni in cui la colposcopia è negativa (assenza di lesione visibile) pur in presenza di un risultato citologico indicativo di patologia o sospetto.
Per migliorare dunque l'efficienza e l'efficacia dello screening sono state messe a punto nuove metodiche: la citologia in fase liquida e la ricerca del virus HPV sul prelievo cervicale.

Citologia in fase liquida

Nel maggio del 1996 la Food and Drug Administration ha stabilito che la citologia in fase liquida è una metodica migliorativa rispetto al Pap test tradizionale: con tale metodica migliorano l'adeguatezza del campione (del 54%), si riduce la percentuale dei falsi negativi con un incremento delle diagnosi di lesioni intraepiteliali dal 65% al 110% e si riduce il numero di ASCed AGC (< al 5%) dovuti ad artefatti.
Una metaanalisi degli studi di confronto tra citologia tradizionale e citologia in fase liquida pubblicata nel luglio 2003 (Gynecologic oncology90; 2003: 137-144) ha evidenziato una sensibilità globale del 76% significativamente maggiore rispetto alla citologia tradizionale.
Dal punto di vista pratico, il prelievo viene effettuato mediante spatola di Ayre in plastica e citobrush oppure con cervex brush (che ha una forma ad ombrello) che andrà ruotato sulla portio per 5 volte consecutive.
Il materiale va quindi stemperato nel mezzo di trasporto liquido ruotando il dispositivo più volte nel mezzo. Il materiale ottenuto viene quindi sottoposto a microfiltrazione per eliminare muco e detriti e separare le cellule che vengono tramite il filtro traferite su vetrino dove sono poi fissate e colorate secondo la metodica di Papanicolau.

I vantaggi della citologia in fase liquida possono così essere riassunti:
- migliore fissazione e preservazione delle cellule;
- migliore visualizzazione delle cellule che non vengono sovrapposte;
- diminuzione degli elementi infiammatori ed ematici che alterano la lettura;
- diminuzione dell'area di lettura;
- diminuzione del tempo di screening;
- possibilità di ottenere più vetrini dallo stesso campione;
- possibilità di ottenere con un solo campione anche il materiale per la ricerca dell'HPV DNA.

Gli svantaggi sono essenzialmente:
- il costo più elevato;
- la necessità di una competenza specifica da parte del citologo (nuovi criteri per la lettura e l'interpretazione dei risultati).

L'HPV DNA TEST

Poiché il virus HPV ed in particolare i tipi ad alto rischio sono i fattori causali del carcinoma della cervice, l'associazione alla citologia di un test che ricerchi il virus migliora l'efficienza dello screening.
Attualmente sono disponibili test commerciali per la identificazione dei tipi virali HPV a basso ed alto rischio.
Si tratta di test di ibridizzazione molecolare effettuati con varie metodiche (Hybrid capture test II e PCR).
Le indicazioni all'impiego dell'HPV test in associazione alla citologia secondo la American Society for Colposcopy and Cervical Pathology 2002 (ASCCP) sono le seguenti:
- in associazione al pap test tradizionale o alla citologia liquida nello screening primario nelle donne di età superiori ai 30 Anni (per diminuire il numero di falsi negativi);
- nel triage dei pap test con risultato ASC ed AGC in sostituzione della ripetizione del Pap test dopo 6 mesi e per stabilire quali pazienti debbano essere avviate alla colposcopia (ASC con HPV positivo --> colposcopia, ASC con HPV negativo --> ripetizione pap test dopo 6 mesi);
- nel follow up delle pazienti trattate per lesioni di alto grado o basso grado persistenti per individuare con maggiore sicurezza le recidive e quindi la necessità di ulteriori terapie.
Attualmente i test commerciali sono molto costosi (in Lombardia nelle strutture convenzionate il ticket previsto è di 46 Euro) e non ovunque disponibili. Inoltre poiché non sono diffuse le tecniche di citologia liquida la paziente effettua 2 prelievi, uno per la citologia ed uno per la ricerca dell'HPV ad alto rischio.
Non si ritiene più indicato eseguire la ricerca dei tipi virali a basso rischio data la loro non rilevanza dal punto di vista oncologico

Le principali caratteristiche dell'HCII (Digene*) sono:
- test più impiegato nel mondo, ha una altissima riproducibilità interlaboratorio ed è l'unico con approvazione FDA;
- tipizzazione tramite chemioluminescenza;
- identificazione dei tipi ad alto rischio (sottotipi: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68);
- possibilità di eseguire il prelievo contestualmente al prelievo citologico con citologia liquida;
- soglia di identificazione pari ad 1 pg di DNA virale per ml;
- sensibilità per la diagnosi di CIN 57%, specificità 97%.

Le principali caratteristiche della metodica PCR MP5/MP6 sono:
- amplificazione del Dna virale tramite polimerasi e successiva ibridizzazione;
- la possibilità di identificare su test positivo tramite HCII, i singoli tipi virali: ciò può essere utile in quanto il potenziale di malattia è differente tra i singoli tipi virali ad alto rischio ed inoltre è possibile comprendere in caso di persistente positività ai controlli successivi se la paziente ha mantenuto lo stesso tipo di virus o ne ha acquisiti di nuovi;
- la possibilità di determinare con precisione la carica virale (tale dato sembra utile soprattutto per valutare il rischio di recidiva nelle pazienti già trattate per lesioni cervicali preinvasive).

DUOPAP

Il duopap associa la citologia in fase liquida con la ricerca HPV ad alto rischio con metodica combinata HCII e PCR.
I suoi vantaggi rispetto alla citologia tradizionale sono:
- un risultato più sensibile e specifico grazie alla citologia in fase liquida;
- la ricerca dell'HPV con un solo prelievo (minore discomfort per la paziente);
- la individuazione del tipo o tipi virali presenti (il rischio di lesioni preinvasive è > per i tipi 16-18 e minore per gli altri);
- la possibilità di identificare le infezioni multiple e riconoscere nel follow up dei casi positivi la persistenza dello stesso tipo di HPV o di acquisizione di nuovi tipi virali;
- la possibilità a richiesta di ottenere il valore della carica virale, utile soprattutto per guidare il clinico nel follow up delle pazienti già trattate per lesioni cervicali preinvasive e nella gestione delle pazienti con citologia normale, ma HPV positive (valutazione della necessità di ripetere controlli citologici ravvicinati o eseguire/ripetere la colposcopia);
- i costi contenuti.

Il duopap rappresenta QUINDI un utile e innovativo strumento diagnostico nello screening delle lesioni cervicali pretumorali,offrendo al ginecologo un test rapido e completo che consente di definire con certezza la negatività del risultato, risolvere i casi dubbi dal punto di vista citologico (ASC-AGC) ed orientare la scelta per l'ulteriore iter diagnostico in caso di positività della ricerca dell'HPV, anche in presenza di citologia normale.
Rappresenta inoltre un valido strumento per il follow up delle pazienti affette da lesioni di basso grado non sottoposte a terapia e per la valutazione del rischio di recidiva delle pazienti trattate in precedenza per CIN.

TRIPAP

Sullo stesso prelievo per il dupap è possibile ricercare contestualmente con metodica di ibridizzazione molecolare Digene la presenza di Clamidia trachomatis.
L'interesse della ricerca di tale agente patogeno è costituito da:
- la Chlamydia Trachomatis è il più diffuso agente di malattia sessualmente trasmessa in grado di determinare infertilità nella donna. La sua importanza è tale che i Centers for disease Control (CDC) ne propongono lo screening in tutte le donne di età inferiore ai 26 anni;
- la Chlamydia Trachomatis sembra essere un fattore di rischio per la persistenza delle infezioni cervicali da HPV ad alto rischio di cui aumenterebbe la capacità di determinare l'evoluzione della infezione in CIN. Numerosi studi degli ultimi 2 anni, tra cui il più significativo è quello dell'International Agengy for Research on Cancer (IARC) evidenziano un aumentato rischio di neoplasia cerviclae nelle donne coinfette da HPV e Chlamidia (O.R. 1.8);
- la infezione da Chlamydia è facilmente curabile tramite una semplice e breve terapia antibiotica: la sua eradicazione raggiungere pertanto lo scopo contemporaneo di eliminare un fattore di rischio per infertilità e un cofattore del rischio oncogeno dell'HPV.

Tripap rappresenta quindi un ulteriore strumento nelle mani del clinico per la prevenzione delle neoplasie cervicali a costi contenuti e con il vantaggio di un unico prelievo.

Prospettive future

Il prelievo in fase liquida fornito da duopap e tripap è estremamente versatile: le metodiche HCII e PCR potranno essere utilizzate in futuro per la ricerca di ulteriori agenti patogeni di rilievo ginecologico, mentre sul prelievo citologico potranno essere ricercati altri fattori di interesse in campo oncologico quali ad esempio la proteina p16ink4a che è considerato attualmente un marcatore di CIN utilizzabile per la distinzione delle semplici infezioni HPV dalle lesioni realmente evolutive.